Identificazione di ceppi di Bacillus mediante MALDI TOF MS utilizzando l'approccio geometrico

Scientific Reports volume 5, numero articolo: 16989 (2015) Citare questo articolo

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L'identificazione dei microrganismi mediante spettrometria di massa MALDI TOF si basa sul confronto dello spettro di massa dell'organismo studiato con quello dei ceppi di riferimento. È un metodo rapido e affidabile. Tuttavia, i database e i programmi commerciali sono progettati principalmente per l’identificazione di ceppi clinicamente importanti e possono essere utilizzati solo per particolari modelli di spettrometro di massa. La necessità di piattaforme aperte e database di riferimento è ovvia. In questo studio descriviamo un approccio geometrico per l'identificazione dei microrganismi mediante spettri di massa e dimostriamo le sue capacità analizzando 24 ceppi appartenenti al gruppo Bacillus pumilus. Questo metodo si basa sulla rappresentazione degli spettri di massa come punti su uno spazio multidimensionale, che ci consente di utilizzare distanze geometriche per confrontare gli spettri. La delimitazione dei microrganismi eseguita mediante approccio geometrico si correla bene con i risultati dell'analisi filogenetica molecolare e del clustering utilizzando Biotyper 3.1. Tutti e tre i metodi utilizzati ci hanno permesso di dividere in modo affidabile i ceppi in due gruppi corrispondenti a specie strettamente imparentate, Bacillus pumilus e Bacillus altitudinis. Il metodo da noi sviluppato sarà implementato in un'interfaccia Web progettata per l'utilizzo di database di riferimento aperti per l'identificazione dei microrganismi. I dati sono disponibili all'indirizzo http://www.bionet.nsc.ru/mbl/database/database.html.

Quando si studiano i ceppi batterici isolati da ambienti estremi, è necessaria un'identificazione rapida e affidabile dei ceppi batterici, compresi quelli del genere Bacillus. Il genere Bacillus contiene batteri Gram-positivi aerobi o anaerobi facoltativi a forma di bastoncello che formano spore intracellulari. Comprende oltre 80 specie valide1. I rappresentanti di questo genere sono abbondanti nel suolo, nell'aria e nell'acqua e sono ampiamente utilizzati come fonti di enzimi industriali per l'industria alimentare, tessile e chimica2. Sono utilizzati anche come ospiti di espressione per geni ricombinanti3, nonché come fonte di geni ricombinanti4. I ceppi di Bacillus sono promettenti per l'agricoltura poiché promuovono la crescita delle piante rizobatteri5 e per l'utilizzo nei sistemi di decontaminazione6,7.

Negli ultimi 30 anni la sistematica del genere è stata sostanzialmente rivista. Alcune specie furono isolate in nuovi generi: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Aneurinibacillus, Brevibacillus, Halobacillus, Virgibacillus, Filobacillus e Jeotgalibacillus. Inoltre, il genere Bacillus contiene diversi gruppi di specie strettamente imparentati, la cui delimitazione è difficile. Ad esempio, il gruppo Bacillus cereus comprende Bacillus cereus, Bacillus anthracis e Bacillus thuringiensis, che sono geneticamente molto simili, ma tuttavia sono considerati specie separate a causa della diversa patogenicità8. Un altro esempio è il gruppo Bacillus subtilis, che contiene la specie Bacillus subtilis subsp. subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus atrophaeus, Bacillus mojavensis, Bacillus vallismortis, Bacillus subtilis subsp. spizizenii e Bacillus sonorensis. Le sequenze del gene 16S rRNA di queste specie hanno una somiglianza di sequenza superiore al 99%, quindi non possono essere distinte basandosi solo su di essa9. Una nuova specie, Bacillus safensis, è stata isolata da B. pumilus in base alla sequenza del gene gyrB10 e altre tre specie sono state descritte utilizzando l'approccio della tassonomia polifasica: Bacillus altitudinis, Bacillus stratosphaericus e Bacillus aerophilus11. Queste specie hanno sequenze del gene 16S rRNA strettamente correlate e formano il gruppo B. pumilus12.

I metodi classici di identificazione dei microrganismi, come i test biochimici e il sequenziamento del DNA, richiedono molto tempo e manodopera. L'approccio sviluppato più recentemente che utilizza la spettrometria di massa MALDI TOF è semplice e rapido. Si basa sul confronto dello spettro proteico del campione studiato con un database di spettri di riferimento13. Diversi studi hanno dimostrato un'elevata riproducibilità di questo metodo a condizione che vengano utilizzati protocolli standard14,15,16,17. È noto che l'accuratezza dell'identificazione tollera condizioni di crescita variabili17,18,19.